LARGE

 

| HOME | CONTACT |
RIKEN CDB
RIKEN CDB

Genome Editing

       
  CRISPR/Cas9による遺伝子改変マウス作製  
 

標的配列を認識するgRNAとCas9 をコードするmRNAを前核期受精卵にinjectionすることにより、高率に遺伝子改変マウスを作製することが可能となっています。従来のES細胞を用いたジーンターゲティング法に比べると作製期間の大幅な短縮が期待できます。

・受精卵 (単純Null、loxPの挿入、塩基置換、ノックインなど)

・ES細胞 (単純Null、多重変異体など)

共同開発をご希望の場合は、mutant(at)cdb.riken.jpへお問い合わせ下さい(at)は@へ変換して下さい)。

 
     
 

Tyr locusを標的とした遺伝子破壊とloxP配列の挿入の例

Tyr遺伝子を標的とするsgRNAとssODN(loxP配列と相同領域)およびCas9 mRNAを黒毛(C57BL/6)マウスの受精卵の"細胞質"へinjectionを行った。黒毛(C57BL/6)のTyr遺伝子を両アレル(biallelic)破壊することで、黒毛が白毛に変わる。また、単一アレル(monoallelic)の破壊では黒毛を示す。

 
   
   
 

235個の卵にCas9 mRNA, sgRNAとssODNをinjectionし、53匹の産仔が得られた。そのうち52匹が白毛であり、両アレルでTyr遺伝子が破壊されたことを示す。また、1匹は黒毛で頭部の一部で白毛であった。

 
  白毛は両アレルが破壊されたことを示す。  
 

仔のテールを用いてsgRNA(Tyr4a)標的サイト周辺ゲノム領域をPCRで増幅し、NheIで処理して電気泳動を行った。53匹中22匹において、NheI処理によりPCR産物が切断された。ssODNのNheIサイトがTyr遺伝子座へ挿入されたことを示す。

 
 

NheIサイトポジティブであることが確認された10個体について、PCR産物をTAクローニングしてシークエンスを行った。10個体全てにおいてloxP配列とNheIサイトが正しく挿入されていることが確認された。また、そのうち4個体ではloxP配列とindelが確認され、正しく挿入されたアレルとindelを含むアレルを持つことが確認された。

 

 
  BACK TO TOP  
理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター 生体モデル開発ユニット/生体工学研究チーム
〒650-0047 神戸市中央区港島南町2-2-3