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RIKEN CDB
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ノックアウトマウスの開発 〜相同組換え体の単離から〜

     
  はじめに  
     
  • "相同組換え体の単離から"とはVector作製、ES細胞のスクリーニングPCR、サザン解析での確認を行って頂きます。当方はVector作製の技術的なアドバイス、ES細胞の操作、キメラマウスの作製を行います。そのため、スクリーニングのPCRは当施設で行って頂きますので、何度か当施設で操作することになります。詳細は共同開発の流れをご参照ください。
  • 同意書微生物学的品質規格についてご確認下さい。CDBの方は所内用のサイトをご覧下さい(http://accc-kobe.cdb.riken.jp/lab/large/koes.html)。
  • Targeting Vectorを作製する前に設計図についてディスカッションを必ず行います。書き方は図(pdf)とプロトコール参照。設計図のPowerPointファイルもあります。
  • 使用するES細胞はTT2細胞(C57BL/6N × CBA)とHK3i細胞(C57BL/6N)です。詳細についてはmutant@cdb.riken.jpまでお問い合わせ下さい。
  • ネガティブセレクションにはDT-Aを使用し、TKセレクションは行いません。
  • 相同組換え体の1stスクリーニングはPCRを用います。サザン解析のみのスクリーニングは行いません。
  • 分与可能なカセットもあります(参照)。
     
  依頼方法  
     

 

 

1.はじめに、申込書を添付してPI(原則として教授)の方よりmutant(at)cdb.riken.jpにご連絡ください。

KOマウス作製申込書(ESから) 必要事項を記入のうえ、メールでmutant(at)cdb.riken.jp に送付して下さい。

 

2.上記ご連絡いただきましたら、こちらから同意書をお送り致します。

共同開発同意書(ESから)

こちらからお送りした同意書2部に遺伝子名を記入し、署名・捺印の上、下記に郵送して下さい。同意書のご署名はPI(原則として教授)にてお願いします。
〒650-0047 神戸市中央区港島南町2−2−3
理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター
生体ゲノム研究チーム

 

3.同意書受領後2週間以内に当方の署名・捺印したものを1部返送致します。初めて申し込まれる研究室には変異マウス作製管理システム(以下;CDB Web)にログインするためのID番号と初期パスワードを発行します。

 

4.ID番号と初期パスワードでCDB Webにログインして下さい。
※以後のご連絡は掲示板で行い、メールでの返信はご遠慮ください。
※ログイン方法についてはこちらを参照して下さい。

 

 
     
  共同開発の流れ  
     
 
は依頼者、は変異マウス開発ユニットの作業を示す
    申込み ⇒依頼方法参照    
 
    CDB Webにログイン    
       
    ディスカッション    
   
Control Vector(以下;CV)構築   Targeting Vector(以下;TV)構築  
PCR条件検討 ⇒詳細   ゲノムサザン条件検討 ⇒詳細
CV導入random integrants ES細胞のPCR(理研にて) ⇒詳細  
 
8割以上のpositive clone?
No Yes  
PCR条件再検討   TV導入ES細胞のPCR(理研にて) ⇒詳細  
 
  ES細胞のgenome southern ⇒詳細
 
  Acc.Noの通知
 
  相同組換え体ES細胞のインジェクション
 
  キメラマウスの作製、送付 ⇒詳細
 
系統保存用F1マウスの送付 ⇒詳細
BRCへの寄託 ⇒詳細
 
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同意書

 
  *本同意書は共同開発頂く研究者と動物資源開発室間の研究者同士の約束であって、大学当局と理研など組織間の契約書ではありません。  
     
  以 下
甲:研究者
乙:CLST生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニット
  1. 乙の助言の下、甲はターゲティングベクター、コントロールベクターを構築し乙に提供する。
  2. ターゲティングベクターの提供を受けた乙は原則として4ヶ月迄を目途に、相同組み換えES細胞を単離し、ジャームラインキメラマウスを作製、甲に提供する。キメラマウスの作製は(TT2或いはHK3iと記入)細胞を用いて行う。
  3. 但し、2.の過程で、相同組み換え体のPCRによる同定、ゲノムサザンによる確認は甲が行うものとする。
  4. 甲はキメラマウス引き渡し通知から1ヶ月以内に同マウスを引き取らなければならない。キメラマウス引き渡しは甲が所属する機関の動物施設に行うものとする。提供するキメラマウスの微生物学的品質規格は乙の指定する規格により、甲は同施設へキメラマウス受け入れを保証するものとする。
  5. 本共同開発により作製した変異マウス系統の所有権は理化学研究所に属する。
  6. 甲はF1世代で可及的速やかに当該変異マウス(heterozygous)の一部(原則雄)を、凍結保存のため乙に提供しなければならない。
  7. 甲は作製した変異マウスの表現型解析に責任をもち、その第一報論文発表に際して乙を共著者とし、その発表には予め乙の同意を得ることとする。
  8. 作製した変異マウスを用いるすべての論文発表においては 当該変異マウスを乙の指定する Acc. No.、および、URL(http://www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)とともに記載することとする。
  9. 甲は、他機関の研究者との共同研究を含め、自らの研究のため当該変異マウスを将来に渡って自由に使用し得る。しかし、当該変異マウスの第三者への分与は乙によってなされるものとする。
  10. 乙は、第一報の論文発表後、当該変異マウスを理化学研究所バイオリソースセンター(以下BRC) の変異マウスバンクに寄託することとする。BRC寄託に際しては分与条件として、甲の指定する条件とともに、当該変異マウスを用いるすべての論文発表に際しAcc. No.、および、URL(http://www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)とともに当該変異マウスを記載し、7項による論文を引用することを義務づけることとする。またBRCよりの当該変異マウス受領者には、当該変異マウスを用いて発表した論文を甲ならびに乙に通知することを求めることとする。
  11. キメラマウスの提供より3年を経ても甲による論文発表がなく、かつこれに対する合理的理由提示のない場合、乙は甲に承認を求めずに、当該変異マウスを国内外の研究者に分与できることとする。この場合、甲は当該変異マウスについて行った表現型解析に関する情報を、乙に提供しなければならないものとする。
  12. 変異マウス作製過程で想定せぬ組換え、欠失、変異などが生じていた場合、乙は速やかに変異マウス作製をやり直し、再作製のための分担金を甲に求めない。
  13. 本共同開発にともなう甲による分担金の支払いについては、共同開発着手時に別途甲とオリエンタル酵母株式会社で支払い契約を結ぶこととする。
  14. 当該変異マウス系統について特許権を取得し、あるいは営利の対象とする場合等は、甲と乙の合意に基づいてのみこれを行うことが出来るものとする。
 
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PCR条件検討

 
     
 
  • 鋳型量0.5fg/50ulの Control Vectorを検出可能な条件が決定したら泳動写真をメールで提出して下さい。送付先:mutant(at)cdb.riken.jp
  • 結果には0、0.5、1、5、10fgの5つの濃度でのデータが必要です(右図参照)。また場合によっては再検討を行って頂くこともあります。
  • Conditional KOの場合は、loxP配列挿入を確信するPCR条件の最適化も行い提出して下さい。また、このPCRは相同組換え体のスクリーニングと同時期に行って頂くことになります。
  • PCR条件などの詳細についてはプロトコールを参照して下さい。
 
  画像をクリックすると拡大します。  
     
 

ゲノムサザン条件検討

 
     
  • サザン解析の条件が決まったら結果を提出してください。送付先:mutant(at)cdb.riken.jp
  • シグナル強度や非特異的なバンドの有無の確認して、条件が十分でない場合は再度行って頂きます。
  • 使用するゲノムはTT2ゲノムを用いてください。TT2ゲノムに関しては一遺伝子あたり50ugまで分与致します。条件検討が難航するようであればB6マウスよりゲノムを精製し、B6ゲノムで行い、TT2ゲノムは最後の確認としてご利用下さい。TT2はB6とCBAのハイブリッドであるため、稀にバンドが二本検出されることがあります。
  • 詳細についてはプロトコールを参照して下さい。
画像をクリックすると拡大します。
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CV導入random integrants ES細胞のPCR(理研にて)

 
     
 
  • 線状化Control Vectorを受け取りましたら、当方でエレクトロポレーション、コロニーピックアップまでを行います。
  • PCRは当施設にて行って頂きます(日程は下記参照)。相同組換え体スクリーニングの際に、サーマルサイクラーや環境の違いによりPCRが再現できないことは致命的となるため、あらかじめ確認を行うためです。
  • PCRポジティブが8割以上得られたら相同組換え体スクリーニングへ進みます。詳細についてはプロトコールを参照して下さい。
 
 
来所時の日程
am11:00〜12:00 Pick upしたES細胞の受け渡し
 (サンプル数;10〜20コロニー)
 ↓
 ↓ ProK処理 1〜3hrs
 ↓
PCR
 
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TV導入ES細胞のPCR(理研にて)

 
     
 
  • サザン解析の条件検討とES細胞におけるランダムインテグレーション検出の条件が決まったら相同組換え体のスクリーニングを行って頂きます。
  • 細胞の状態によりますが、2日間で最高192クローンについてスクリーニングが可能です。
 
 
来所時の日程(相同組換え体の単離)
DAY1
am11:00〜12:00 Pick upしたES細胞の受け渡し(サンプル数:48コロニー)
 ↓ProK処理 1〜3hrs
PCR
pm3:00〜4:00 Pick upしたES細胞の受け渡し(サンプル数:48コロニー)
 ↓ProK処理 1〜3hrs
PCR、ゲル作製
DAY2
1日目に処理した96コロニー分の結果を2日目の10時までに報告して下さい(時間厳守)。組換え体が10クローンに満たない場合はさらに96クローン行います(工程は一日目と同様)。
※細胞の状態によっては合計192クローンをpick upできない場合もあります。
 
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ES細胞のゲノムサザン

 
     
 
  • 組み換え体と同定されたクローンを継代培養して2週間から3週間後にペレットの状態で送付致しますので、5'、3'側、Neoプローブでサザン解析を行いデータをmutant(at)cdb.riken.jpへ送付して下さい。
  • サザン解析についてはプロトコールを参照して下さい。
  • サザン解析の結果に基づいてキメラマウス作製を開始します。
 
     
 

キメラマウスの送付

 
     
 
  • 当方からのマウス搬出にあたって搬入先の『遺伝子組み換え実験計画書の承認印付きのものコピー(通知書及び実験計画書)』を提出していただく必要があります。メール添付(mutant@cdb.riken.jp)もしくはFAX(078-306-3337)にてお送り下さい。
  • 上記に該当する書類がない場合、および当方が提出すべき書類がある場合はお早めにご連絡ください。
  • 当方よりのキメラマウス引き渡し通知から実際のキメラマウス搬送までを1ヶ月以内とします。
  • 運搬費用は作製費用には含まれておりませんのでご注意下さい(原則として依頼者の負担となります)。
  • キメラマウスを野生型C57BL/6 (若しくはCBA)と交配し、得られたF1マウスに対して、速やかにgenotyping(PCR、サザン解析)を行い、データを当方へ提出して下さい(プロトコール)。なお、サザン解析はPCRの正確性を確認するためのものであり、一度確認できれば以後はPCRで構いません。その結果を、mutant(at)cdb.riken.jpへ送付して下さい。
 
     
 

系統保存用F1マウスの送付

 
     
 
  • 系統保存のため、キメラ変異マウスより得られたヘテロ変異マウス(F1世代、♂2〜3匹/1ライン、12週齢〜40週齢)を可及的速やかにCLST生体ゲノム工学研究チームに送付してください。
  • 当研究所にマウスを搬入する際、搬入マウスの情報提供書と微生物検査書が必要となります。メール添付(mutant@cdb.riken.jp)もしくはFAX(078-306-3337)にてお送り下さい。
    微生物検査を行っていない場合(conventional飼育)はその旨お知らせ下さい。
 
     
 

BRCへの寄託

 
     
 
  • 凍結保存胚の一部を理化学研究所バイオリソースセンターへ寄託します。寄託手続きやマウス(凍結保存胚)の搬出は変異マウス開発ユニットが行います。
  • 寄託に際しては、(1)分与に際しては甲の合意を得ること、(2)論文発表に際し当該変異マウスの由来に関し第一報を引用しAcc. No.を記載すること、(3)発表論文を生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニット、研究者に連絡することを分与条件とします。この際、共同開発依頼者は、分与依頼者との協議により、共同研究とする、研究目的を限定する、その他の条件を指定することができますし、分与を拒否することもできます。協議が成立しましたら、CLST生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニットにご連絡下さい。その条件の下での変異マウス分与をBRCに依頼します。
 
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理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター 生体モデル開発ユニット/生体工学研究チーム
〒650-0047 神戸市中央区港島南町2-2-3