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ノックアウトマウスの開発 〜ベクター構築から〜

     
   
     
 
  • "ベクター構築から"はターゲティングベクター作製からキメラマウス作製を当方が行います。そのためF1マウスのgenotypingの条件検討、サザン解析での確認、以後のgenotypingは行って頂くことになります。なお、サザン解析は必須となります。またマウスgenotypingのサザン解析はお引き受けしておりませんので、ご了承ください。
  • 同意書微生物学的品質規格についてご確認下さい。CDBの方は所内用のサイトをご覧下さい(http://accc-kobe.cdb.riken.jp/lab/large/kotv.html)。
  • 使用するES細胞はTT2細胞(C57BL/6N × CBA)とHK3i細胞(C57BL/6N)です。詳細についてはmutant@cdb.riken.jpまでお問い合わせ下さい。
  • Constructionに関しては、Neoの単純挿入によるnull変異ノックイン(LacZ、GFP、Cre、その他の遺伝子を代わりに発現させる)、Conditional KOをお引き受けしていますが、破壊方法はディスカッションによって決定致します。特殊な変異について、申し込み前にご相談ください。Constructionに関して双方合意した時ベクター構築を開始しますが、予期出来ず生じたトラブルについては双方の責任で対処することとなります。
  • 作製開始からキメラマウス完成までおよそ8ヶ月間を要します(遺伝子のlocusによって左右される場合もあります)。
  • Conditional KOは http://www.cdb.riken.jp/arg/cassette.html のVecotor 20.21.で作製しますので、標的exonはloxP、NeoはFRTで挟むことになります。またES細胞でFlpを発現させることは行っておりませんので、Flpマウスが必要となります。
 
     
   
     
 

1.はじめに、申込書を添付してPI(原則として教授)の方よりmutant(at)cdb.riken.jpにご連絡ください。

KOマウス作製申込書(vectorから) 必要事項を記入のうえ、メールでmutant(at)cdb.riken.jp に送付して下さい。

 

2.上記ご連絡いただきましたら、こちらから同意書をお送り致します。

共同開発同意書(vectorから)
こちらからお送りした同意書2部に遺伝子名を記入し、署名・捺印の上、下記に郵送して下さい。同意書のご署名はPI(原則として教授)にてお願いします。
〒650-0047 神戸市中央区港島南町2−2−3
理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター
生体ゲノム工学研究チーム

 

3.同意書受領後2週間以内に当方の署名・捺印したものを1部返送致します。初めて申し込まれる研究室には変異マウス作製管理システム(以下;CDB Web)にログインするためのID番号と初期パスワードを発行します。

 

4.ID番号と初期パスワードでCDB Webにログインして下さい。
※以後のご連絡は掲示板で行い、メールでの返信はご遠慮ください。
※ログイン方法についてはこちらを参照して下さい。

 
     
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は依頼者、は変異マウス開発ユニットの作業を示す
    申込み ⇒依頼方法参照    
 
    CDB Webにログイン    
       
    ディスカッション ⇒詳細    
   
Control Vector(以下;CV)構築   Targeting Vector(以下;TV)構築  
PCR条件検討   ゲノムサザン条件検討
CV導入random integrants ES細胞のPCR(理研にて)  
 
8割以上のpositive clone?
No Yes  
PCR条件再検討   TV導入ES細胞のPCR(理研にて)  
 
  ES細胞のgenome southern
 
  Acc.Noの通知
 
  相同組換え体ES細胞のインジェクション
 
  キメラマウスの作製、送付 ⇒詳細
 
系統保存用F1マウスの送付 ⇒詳細
BRCへの寄託 ⇒詳細
 
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同意書

 
  *本同意書は共同開発頂く研究者と動物資源開発室の研究者同士の約束であって、大学当局と理研など組織間の契約書ではありません。  
     
  以 下
甲:研究者
乙:CLST生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニット
  1. 甲は該当遺伝子に関する情報(cDNA配列、アミノ酸配列、発現パターン等)を乙に提供する。
  2. 乙は原則として8ヶ月以内に、ジャームラインキメラマウスを作製し甲に提供する。キメラマウスの作製は(TT2或いはHK3iと記入) 細胞を用いて行う。
  3. 甲はキメラマウス引き渡し通知から1ヶ月以内に同マウスを引き取らなければならない。キメラマウス引き渡しは甲が所属する機関の動物施設に行うものとする。提供するキメラマウスの微生物学的品質規格は乙の指定する規格により、甲は同施設へキメラマウス受け入れを保証するものとする。
  4. 本共同開発により作製した変異マウス系統の所有権は理化学研究所に属する。
  5. 甲はF1世代で可及的速やかに当該変異マウス(heterozygous)の一部(原則雄)を、凍結保存のため乙に提供しなければならない。
  6. 甲は作製した変異マウスの表現型解析に責任をもち、その第一報論文発表に際して乙を共著者とし、その発表には予め乙の同意を得ることとする。
  7. 作製した変異マウスを用いるすべての論文発表においては 当該変異マウスを乙の指定する Acc. No.、および、URL(http://www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)とともに記載することとする。
  8. 甲は、他機関の研究者との共同研究を含め、自らの研究のため当該変異マウスを将来に渡って自由に使用し得る。しかし、当該変異マウスの第三者への分与は乙によってなされるものとする。
  9. 乙は、第一報の論文発表後、当該変異マウスを理化学研究所バイオリソースセンター(以下BRC) の変異マウスバンクに寄託することとする。BRC寄託に際しては分与条件として、甲の指定する条件とともに、当該変異マウスを用いるすべての論文発表に際してAcc. No.、および、URL(http://www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)とともに当該変異マウスを記載し、6項による論文を引用することを義務づけることとする。またBRCよりの当該変異マウス受領者には、当該変異マウスを用いて発表した論文を甲ならびに乙に通知することを求めることとする。
  10. キメラマウスの提供より3年を経ても甲による論文発表がなく、かつこれに対する合理的理由提示のない場合、乙は甲に承認を求めずに、当該変異マウスを国内外の研究者に分与できることとする。この場合、甲は当該変異マウスについて行った表現型解析に関する情報を、乙に提供しなければならないものとする。
  11. 変異マウス作製過程で想定せぬ組換え、欠失、変異などが生じていた場合、乙は速やかに変異マウス作製をやり直し、再作製のための分担金を甲に求めない。
  12. 本共同開発にともなう甲による分担金の支払いについては、共同開発着手時に別途甲とオリエンタル酵母株式会社で支払い契約を結ぶこととする。
  13. 当該変異マウス系統について特許権を取得し、あるいは営利の対象とする場合等は、甲と乙の合意に基づいてのみこれを行うことが出来るものとする。
 
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ディスカッション

 
     
 
  • まずは同意書と一緒に送付されたIDとパスワード(初期パスワードは必ず変更してください)でCDB Webにログインし、"Detail"のボタンをクリックして、cDNAとアミノ酸配列を登録してください。
  • 次に"Message"のボタンをクリックして、掲示板へ配列を登録したことと、ターゲットするexonとその破壊方法をご連絡ください("Send Message")。
  • その情報を元にこちらで確認を行います。
  • なお、標的exonが決まってない場合はディスカッションにより決定致します。標的exonについてはhttp://www.cdb.riken.jp/arg/protocol.html01.ノックアウトマウスと設計図をご参照ください。
  • Conditional KOはhttp://www.cdb.riken.jp/arg/cassette.html のVecotor 20.21.で作製しますので、標的exonはloxP、NeoはFRTで挟むことになります。またES細胞でFplを発現させることは行っておりませんので、Flpマウスが必要となります。
 
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キメラマウスの送付

 
     
 
  • キメラマウスを送付する時期に、genotyping PCRのポジティブコントロールとしてTargeting Vectorとサザン解析プローブの鋳型、ゲノム配列などが示してある資料を送付致します。それをもとにgenotyping PCRの条件を決定し、F1マウスのgenotypingを行って下さい(条件検討のプロトコールはこちらからダウンロードできます)。
  • Condtional KOの場合はloxP配列が挿入されていないことがありますので、loxP配列の挿入が確認できるGenotyping PCRも行ってください。
  • 当方からのマウス搬出にあたって 搬入先の『遺伝子組み換え実験計画書の承認印付きのものコピー(通知書及び実験計画書)』を提出していただく必要があります。書類をメール添付(mutant@cdb.riken.jp)もしくはFAX(078-306-3337)にてお送り下さい。
  • 上記に該当する書類がない場合、および当方が提出すべき書類がある場合はお早めにご連絡ください。
  • 当方よりのキメラマウス引き渡し通知から実際のキメラマウス搬送までを1ヶ月以内とします。
  • 運搬費用は作製費用には含まれておりませんのでご注意下さい(原則として依頼者の負担となります)。
  • キメラマウスを野生型C57BL/6 (若しくはCBA)と交配し、得られたF1マウスに対して、速やかにgenotyping(PCR、サザン解析)を行い、データを当方へ提出して下さい。なお、サザン解析はPCRの正確性を確認するためのものであり、一度確認できれば以後はPCRで構いません。
 
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系統保存用F1マウスの送付

 
     
 
  • 系統保存のため、キメラ変異マウスより得られたヘテロ変異マウス(F1世代、♂2〜3匹/1ライン、12週齢〜40週齢)を可及的速やかにCLST生体ゲノム工学研究チームに送付してください。
  • 当研究所にマウスを搬入する際、搬入マウスの情報提供書と微生物検査書が必要となりますので、メール添付(mutant@cdb.riken.jp)もしくはFAX(078-306-3337)にてお送り下さい。
    微生物検査を行っていない場合(conventional飼育)はその旨お知らせ下さい。
 
     
 

BRCへの寄託

 
     
 
  • 凍結保存胚の一部を理化学研究所バイオリソースセンターへ寄託します。寄託手続きやマウス(凍結保存胚)の搬出は生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニットが行います。
  • 寄託に際しては、(1)分与に際しては甲の合意を得ること、(2)論文発表に際し当該変異マウスの由来に関し第一報を引用しAcc. No.を記載すること、(3)発表論文を生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニット、研究者に連絡することを分与条件とします。この際、共同開発依頼者は、分与依頼者との協議により、共同研究とする、研究目的を限定する、その他の条件を指定することができますし、分与を拒否することもできます。協議が成立しましたら、CLST生体ゲノム工学研究チーム / 生体モデル開発ユニットにご連絡下さい。その条件の下での変異マウス分与をBRCに依頼します。
 
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理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター 生体モデル開発ユニット/生体工学研究チーム
〒650-0047 神戸市中央区港島南町2-2-3