One-Step法：1kp以上の場合は、2種類のgRNAsと2種類のssODNsを用いて作製します。

Two-Step法：同一アレルへ2つのloxPが挿入されなかった場合は、1つのloxPが挿入されたF0マウス♂(もう一つは野生型のままである必要がある)を用いて野生型マウスとIVFして凍結胚を作製する。残りのloxPをその卵へinjectionにより挿入します。
＊IVFと追加のmicroinjectionには追加費用が必要になります。

One-Step法で作製した場合に得られる可能性のあるアレル：

Floxする領域が、10kb以上の場合は(long PCRやサザン解析による確認が不可能な長さ)、Flox候補F0マウスを野生型マウスと交配して得られたF1マウスを解析することで確認を行う必要があります。

One-Step：1kb以下の場合は、2種類のgRNAと2つのloxPを含むDonor plasmidを用いて作製することができます。
Reference: Aida T., et al. (2016). Gene cassette knock-in in mammalian cells and zygotes by enhanced MMEJ