1. スクリーニングPCR条件の最適化をcontrol vectorを用いて行います (PDF)。PCR条件はこちらをご参照ください(PDF)。

またPCR条件が決まったらtargeting vectorの作製を開始します。

2. PCR条件が決まったらcontrol vecorをES細胞へランダムインテグレーションさせて、PCR条件の確認を行います(PDF)。

サザン解析の条件検討も行います(PDF)。

3. PCRとサザン解析の条件が決まり、targeting vectorが完成したら相同組み換え体ES細胞のスクリーニングを行います。

4. 1stスクリーニングはlong PCRを用いて96~192個のNeo耐性コロニーに対して行います。

Conditional KOの場合はloxP配列が挿入されていないことがありますので、loxP配列の挿入が確認できるGenotyping PCRも行ってください(PCRについてはこちらをご参照ください)。

5. 2ndスクリーニングはlong PCRポジティブES細胞についてサザン解析を行います。